一、引言 有效微生物(effectivemicroorganisms, EM原露)是日本琉球大学比嘉照夫教授于本世纪80年代初研制而成的新型复合微生物菌剂,它是由光合细菌、放线菌、酵母菌、乳酸菌、芽胞杆菌、真菌、双歧杆菌等10个属80多种微生物复合培养而成的多功能菌群。该菌剂不含任何化学有害物质,无毒副作用,不污染环境,具有组成复杂,结构稳定,功能广泛的特性,用于动植物生产中,可以增强抗病能力,促进生长,提高产量,改善产品品质,并且还可以消除畜禽粪便恶臭,净化环境,具有显著的经济、生态和社会效益。目前,EM原露技术不但在日本已经广泛推广,而且也开始在泰国、马来西亚、巴西、美国、台湾等许多国家和地区应用。 我国自1992年引进以来,广大科研人员进行了大量的研究和推广工作,并已取得初步成功。 微生态学是近些年兴起的一门新兴学科,该方面的研究十分活跃。许多学者利用微生态制剂在提高蛋白质利用率、生产微生物蛋白饲料、提高动物生产性能等方面进行了大胆探索。我国著名微生物专家、营养学家王厚德教授通过双面通风固体发酵新工艺研制出的饲料酵母饲喂畜禽效果良好,可全部或部分代替进口鱼粉(李维炯等,1996)。贺建华报道(1992),用微生物可以改善羽毛粉的营养价值,给肉鸡饲喂厌氧发酵的羽毛粉,营养价值高于有氧发酵羽毛粉。另有研究表明,利用地衣芽胞杆菌(pwd-1株)发酵处理羽毛粉可产生大量游离氨基酸和肽,这种羽毛水解物产品可部分代替豆粕作为蛋白源用于畜禽日粮,并可降低生产费用(卢智文,1992)。我国是一个饲养大国,年养猪近4亿头,养牛马等大家畜1亿多头,养鸡30多亿只。近些年畜牧业的不断发展,对蛋白质饲料的要求越来越多。但是,我国的蛋白质资源相当匮乏,尤其是鱼粉等高蛋白饲料主要依靠进口。国家每年要为此花费大量的外汇,仅1989年就进口鱼粉47.6万t,仍满足不了市场的需要,且价格昂贵,给养殖业带来了困难。如果EM原露能提高蛋白质利用率或能通过EM原露的转化作用提高某些限制性氨基酸的含量,或利用对某些农副产品、下脚料或废弃物进行二次发酵,提高它们的利用率,其意义是相当巨大的。 EM在提高畜禽生产性能和饲料转化效率等方面已有很多报道(李维炯等,1996),但EM原露对肉鸡饲料营养价值、免疫功能和腹部脂肪沉积的影响还未见报道。鉴于上述,本试验采用EM原露对饲料进行发酵,研究饲料在发酵不同时间,其中粗蛋白、氨基酸、PH值的变化情况,以及饲料中不同EM原露水平对肉鸡生产性能、免疫器官生长发育、免疫功能和脂肪沉积等方面的影响。该方面的研究有助于进一步探讨EM原露在肉鸡养殖上的效果和阐明EM原露的作用机理。 二、材料与方法 1.试验材料及设计 ⑴试验动物、日粮及饲养管理:试验用1日龄AA商品代肉用公雏126只,随机分成三组,每组42只,育雏一周后每组分成3个重复,使每组的初始体重一致。 试验鸡分三层笼养,暖气控温,开始室温32℃,以后逐渐降到2周末时28-30℃,后期为夏季自然温度(高温季节)24小时光照,自由采食饮水,试验期6周。1日龄胫部皮下注射马立克(MDV)冻干疫苗(HTV株,SOLVAY动物保健品公司生产)0.2ml/只,滴鼻点眼传染性法氏囊(IBV)疫苗(MB株,以色列ABIC公司生产)各1滴;7日龄接种新城疫(NDV)冻干苗(clone-30,INTERVET公司生产)点眼、滴鼻各1滴,腹腔注射绵羊红血球(SBRC)3.6×108个/只,左右大腿肌肉各注射0.5%的牛血清白蛋白(SBA)0.5ml(折合2.5mg/只);14日龄同前法进行MDV、NDV、SBRC和SBA强化免疫,以进行特异性抗体监测。试验基础日粮见表1。 表1 肉仔鸡优化配方营养水平 原料名称 配比(%) 0-3周 4-6周 营养素 营养水平 0-3周 4-6周 玉米 豆粕 小麦麸 鱼粉(进口,秘鲁) 石粉 植物油 蛋氨酸 骨粉 食盐 复合预混料 55.45 61.31 31.74 25.64 2.00 3.00 3.20 3.50 0.793 0.820 3.393 3.115 0.166 0.066 1.467 1.319 0.253 0.237 1.000 1.000 代谢能(MJ/kg)粗蛋白(%) 钙(%) 有效磷(%) 赖氨酸(%) 蛋氨酸(%) 蛋+胱(%) 食盐(%) 12.98 12.98 22.00 20.00 1.05 1.00 0.51 0.45 1.20 1.05 0.54 0.47 0.90 0.75 0.40 0.37 注:每千克日粮含铜11mg,碘0.44mg,铁110mg,锰100mg,硒0.25mg,锌120mg,钴0.40mg,维生素A8800IU,维生素D33000IU,维生素E22.5IU, 维生素K31.8mg,生物素0.2mg,叶酸1.0mg,尼克酸50mg,泛酸11mg,核黄素6.6mg, 硫胺素3.0mg,吡哆醇4.4mg,维生素B120.02mg,胆碱1300mg。 ⑵试验设计 表2 试验设计 组别 A B C 日粮 B(对照) B+EM原露10 B+EM原露30 添加量(%) 0 0 0 重复 1 2 3 1 2 3 1 2 3 鸡数(n) 14 14 14 14 14 14 14 14 14 鸡数/组 42 42 42 注:B=基础日粮,EM原露10=添加EM原露发酵饲料10%,EM原露30=添加EM原露发酵饲料30%;B组日粮中实含EM原露原液1‰,C组日粮实含EM原露原液3‰。 ⑶试验饲料的发酵制作 ①制法:a.配料,按1kgEM原露原液+1kg红糖+35kg水+100kg 饲料的比例配制,即先按饲料量1%比例称取EM原露红糖,再按饲料量35 %的比例称取水(无漂白粉,若有漂白粉先在阳光下暴气1天后使用),将EM原露和红糖均匀混于水中, 然后喷洒饲料,边喷洒边搅拌,使含水量约35%,以后握成团而不出水,落地自然散开为度。b.装料,将混合好的饲料装入2-3层塑料袋中捆紧袋口,以防空气进入。c.发酵,适宜温度为28-30℃(夏季室温即可),时间5天。 ②饲喂方法:将发酵后的饲料按10%或30%的比例加到基础料中混匀进行饲喂,饲料如在短期内喂不完,要置于厌氧状态下保存,有效期夏季为一周,冬季为一个月。 2.检测指标和测定方法 ⑴EM原露发酵饲料不同日龄的粗蛋白和氨基酸含量:取全价配合饲料以及发酵1天、3天、5天的饲料各3份,用凯氏定氮法测定粗蛋白, 用高效液相色谱法(HBLC)测定18种氨基酸的含量(以干物质计)。 ⑵EM原露发酵饲料不同日龄的PH值:取不同日龄饲料各10g 于小烧杯中, 加50ml蒸馏水溶解,用PH计测定发酵饲料以及混合饲料的PH值。 ⑶生产性能:每周周末称重、称料、计算料重比和各种平均重。 ⑷免疫器官重量:分别于28日龄和42日龄,每组取6只鸡,心脏采血后屠宰, 摘取脾脏、法氏囊以及左侧胸腺,剔除脂肪后称鲜重,计算免疫器官重与体重相对重量得到胸腺脂数、脾脏指数、法氏囊指数,以每千克体重所占免疫器记的克数表示(g/kg体重)。 ⑸腹部脂肪重量:在6周龄时,每组取9只鸡屠宰,剖开腹腔剥离腹部脂肪称鲜重,以千克体重所含腹脂的克数计算(g/kg体重)。 ⑹细胞免疫功能测定即外周血T或B淋巴细胞对促有丝分裂原刺激的反应性(又称淋巴细胞转化试验):淋巴细腻转化试验是在体外,利用淋巴细胞与抗原或促有丝分裂原(又称丝裂原或刺激原等)共同培养时,淋巴细胞的代谢和形态发生一系列变化,进一步转化为具有淋巴细胞的特性为检测免疫功能和的一种试验手段,是特异性细胞免疫的一个测定指标(杜念兴,1984,Kirchner等,1972),其结果可用淋巴细胞转化率(形态学法)和脉冲数(CPM)或刺激指数(3H-胸腺嘧啶核苷放射性同位素掺入法)来表示。 淋转中目前最常用的B细胞分裂原是脂多糖(LPS),T细胞丝裂原主要有植物血凝素(PHA)和刀豆素或伴刀豆蛋白A(ConA)。 为了克服放射性同位素的污染和核辐射问题,近年来发展起来的一路最新的监测方法,称BrdU-ELISA即通过定量测定BrdU(5-Bromo-2 ’-deoxyuridine,5-溴-2’-脱氧尿嘧啶)掺入到细胞增殖(复制)时新合成的DVA中的数量,来检查淋巴细胞的分裂情况或活性。试验用德国东方宝林曼公司生产的“细胞增殖BrdU-ELISA试剂盒”测定。 淋巴细胞收集:在6周龄时,从每组随机选6只鸡,在无菌状态下进行以下全部操作,心脏采血3-4ml,肝素抗凝(25单位/ml血)。灭菌尖嘴离心管,每管加入比重=1.063的无菌Percell细胞分离液0.5ml(Pharmacia公司生产),然后沿管壁缓缓加入1ml全血,盖上灭菌橡胶塞,用水平离心机离心(3000rpm×20min )分离外周血淋巴细胞,共得到4个分层。用无菌1ml加样器小心吸取上数第二层中的淋巴细胞,放到无菌离心管中,加入细胞层总体积1/4的RPMI1640细胞培养液(分别含青霉素100单位和链霉素100mg/ml,5%的灭活犊牛血清), 再次洗涤离心(3000rpm×15min),弃上清液,加入RPMI1640培养液2ml,混匀, 盖上灭菌橡胶塞。从中吸取50ul细胞液与2950ul的含0.16%曲利本蓝(Trypan blue)的无钙镁Hank’s细胞平衡液,混匀。用血球计数板在显微镜下计数活的淋巴细胞(死细胞蓝染),然后用RPMI1640细胞培养液将淋巴细胞浓度调整到5×107个/ml。 细胞培养:用RPMI1640培养液(含双抗)配制丝裂原,ConA浓度为45ug/ml,LPS浓度为25ug/ml,96孔组织细胞培养板(平底)培养细胞,ConA和LPS各做2孔,每孔加50ul刺激原。同时作空白对照和特异性对照,按表3加样。然后,在每孔中各加入调好浓度的淋巴细胞液50ul(即2.5×106个/孔),放入细胞培养箱中培养(40-41℃,5%CO2,95%湿度)56小时后,取出加入BrdU标记物10ul/孔,继续培养16小时,作空白处理。 培养样品处理与结果表示:从培养箱中取出96孔培养板,在倒置显微镜下观察其细胞培养情况。倾去孔中的培养液,倒置在吸水纸上,吸去余液;加固定剂(随试剂盒)200ul/孔,在室温下孵育30min,同前法移去固定剂,加入抗BrdU-底物酶(随试剂盒)100ul/孔,在室温下孵育30-120min,用洗涤液洗3次,倒置在吸水低上轻拍,加底物(试剂盒中)在室温孵育30min。 表3 对照处理 培养孔内容物 容白对照 特异性或背景对照 培养介质(RPMI1640) 淋巴细胞 BrdU标记物 抗BrdU-底物酶 100ul - 10ul 10ul - 100ul - 100ul 最后,各孔加1M的H2SO450ul终止反应。用酶联检测仪在450nm波长处测定各孔的吸光度(ABS)值表示淋巴细胞转化率,求出每样两个重复的平均值代表该样的淋巴细胞转化率。 ⑺体液免疫测定:BSA、SBRC、NDV和MDV特异性抗体的测定,用酶联免疫吸附验(ELISA)方法。 3.数据处理 用SAS统计程序软件包进行方差分析和Dancan’s多重比较,并求出EM原露发酵饲料添加量与指标间的预测方程。 三、结果与讨论 1.EM原露液发酵饲料过程中,对饲料理化性状的影响 ⑴颜色、气味:用EM原露发酵饲料过程中,从0-5天,颜色逐渐加深,由淡黄色变成深黄色。气味从淡淡的醇味到较浓的醇香味。 ⑵不同发酵天数对饲料PH值的影响。 表4 发酵天数对饲料PH值、粗蛋白含量的影响 饲料类型发酵0天发酵1天发酵3天发酵5天 B+EM原露10 B+EM原露30 5天 5天 PH值 7.3±0.17a 7.1±0.17a 6.8±0.06a 5.9±0.06b 粗蛋白(%) 21.55±0.32b 22.14±0.10b 22.93±0.38a 23.21±0.19a 6.5±0.01b 6.1±0.06a 21.72±0.31a 22.05±0.28b 注:同行数字右肩标有不同字母的表示存在显著差异(P〈0.05);反之,无显著差异(P〉0.05)。从表4可以看出,随发酵天数的增加,PH值逐渐下降,0,1,3天差异不显著(P)0.05);发酵5天的饲料,PH值明显降低,与不发酵、发酵1天、3天的饲料比较,PH值差异显著(P〈0.05)。在基础料中添加10%和30 %的发酵5天的饲料后,二者PH值差异显著(P〈0.05)。说明用EM原露液发酵饲料后, 对饲料有酸化作用(acidification), 这能激活与蛋白质和碳水化合物代谢有关的酶,从而提高它们的利用率。有研究表明,饲料的PH直接影响胰蛋白酶、糜蛋白酶、羧肽酶、淀粉酶、脂肪酶、麦芽糖酶和乳糖酶等的功能。进而影响日粮总的消化率,最终影响动物生长和饲料转化率。胃蛋白酶消化的适宜PH为1.5-3.5,成年鸡腺胃PH4.3-4.6,肌胃2.8-3.0,小肠6-7。但幼龄动物胃酸分泌不足,胃肠道PH常常偏高,不利于上述消化酶的激活。正常情况下,动物体内的消化和生物化学反应(或作用过程)主要是根据环境中的PH值和最适温度,,酶在特定的PH和温度条件下才能活动或发生反应,消化酶通常是在酸性的PH下活动的。例如,水解淀粉是淀粉酶在PH6.5时发生水解, 而葡萄糖淀粉酶分解糊精是当PH4.4时才发生。因此, 酸化作用在未成熟动物或幼龄动物的消化道中使生产的低水平提高,有助于消化过程(戴卓见,1995)。 此外,酸化可以阻止大肠杆菌等有害微生物的生长和繁殖,刺激有益菌的生长;还可补充胃中的限制酸,对能量代谢产生有利影响;有机酸作为一种螯合剂,促进后肠中钙、磷等矿物质的吸收。畜禽体内的有益菌和病原菌存在着精致的平衡,这种平衡关系对PH很敏感,低的PH值(4-5)有利于乳酸菌和链球菌,而高的PH(6-7)则有益于大肠杆菌(李文立译,1990)。 还有试验证明,粪便PH和氨的释放有直接关系,当PH〈7时,NH3释放很少;当PH〉8时,NH3的释放加快(Reece et al.,1979)。康白(1988 )报道,分解氨基酸产生NH3的微生物是革兰氏阴性菌如大肠杆菌、变性杆菌、 铜绿色单胞杆菌等,有些微生物如革兰氏阳性的乳酸杆菌、双歧杆菌几乎不分解氨基酸。EM原露原液的PH为3.8, 发酵过程中的酸化作用可以部分解释EM原露除臭降氨的机理。 2.不同发酵天数对饲料粗蛋白含量的影响从表4可以看出,随发酵天数的增加,粗蛋白含量逐渐增加,不发酵和发酵1天的差异不显著(P〉0.05 ),发酵3天和发酵5天的差异不显著(P〉0.05),发酵3天和5天的饲料与不发酵和发酵1天的相比,蛋白含量差异显著(P〈0.05)。在基础料中添加10%和30 %发酵5天的饲料后,二者粗蛋白含量差异显著(P〈0.05),说明EM原露菌液可提高饲料粗蛋白含量,其原因可能与下列因素有关:①菌液中本身含有蛋白,至少培养基中含有氮源;②EM原露中含有大量放线菌(试验品〉107个/ml)、 部分醋酸杆菌和光合细菌,具有合成氮素的作用;③厌氧发酵饲料过程中产热,消耗了能量饲料,从而使蛋白质含量相对增加;④菌液中含有大量的微生物蛋白。 3.不同发酵天数对饲料中各种氨基酸含量的影响 表5 发酵天数对饲料各种氨基酸含量(占干物质%)的影响 序号 英文 缩写 氨基酸 中文名 基础料 发酵 1天 比发酵前增% 发酵 3天 比发酵前增% 发酵 5天 比发酵前增加% 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 Asp Ser Glu Thr Gly Arg Ala Tyr Pro Val Phe Leu Ile His Lys Met Cys Trp 天门冬酸 丝氨酸 谷氨酸 苏氨酸 甘氨酸 精氨酸 丙氨酸 酪氨酸 脯氨酸 缬氨酸 苯丙氨酸 亮氨酸 异亮氨酸 组氨酸 赖氨酸 蛋氨酸 胱氨酸 色氨酸 总氨基酸 平均增加 1.79 1.79 2.31 0.93 0.90 1.36 1.11 0.68 1.26 0.98 4.44 0.89 1.57 0.84 0.77 0.45 0.37 0.18 22.02 1.95 1.27 2.47 0.99 0.95 1.50 1.13 0.70 1.29 1.06 4.62 0.93 1.70 0.92 0.93 0.52 0.39 0.21 23.53 8.94 6.72 6.93 6.45 5.56 10.29 1.80 2.94 2.38 8.16 4.05 4.49 8.28 9.52 20.78 15.56 5.41 16.67 2.01 1.32 2.61 1.07 1.00 1.60 1.22 0.76 1.42 1.16 5.03 1.01 1.74 0.95 0.94 0.55 0.41 0.21 25.01 +8.05 12.29 10.92 12.99 15.05 11.11 17.65 9.91 11.76 12.70 18.37 13.29 13.48 10.83 13.10 22.08 22.22 10.81 16.67 +13.58 2.06 1.33 2.65 1.16 1.02 1.65 1.24 0.86 1.42 1.18 5.06 1.04 1.78 0.97 0.95 0.59 0.42 0.23 25.61 15.08 11.76 14.72 24.73 13.33 21.32 11.71 26.47 12.70 20.41 13.96 16.85 13.38 15.48 23.38 31.11 13.51 27.78 +16.30 从表5和图3可以看出,用EM原露液发酵饲料1天后,所有氨基酸含量都升高。发酵3天后都有较大幅度地升高,发酵5天后,氨基酸增加的幅度变小。从总的趋势看,在饲料发酵后的1-3天内氨基酸增加幅度较大,3天后虽然有所增加, 但幅度明显变小。苏氨酸、精氨酸、酪氨酸、缬氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、色氨酸的增加幅度超过20%,天门冬氨酸、亮氨酸、组氨酸的增中幅度介于15%-20%,其它氨酸的升高幅度介于10%-15%之间。饲料发酵1、3、5天后,其总氨基酸的增加量分别为8.05%、13.58%和16.3%。 经过EM原露发酵,氨基酸谱发生较大变化,赖氨酸、色氨酸、精氨酸、苏氨酸都有较大幅度的增长(20%以上),明显提高肉仔鸡日粮的营养价值。赖氨酸是肉仔鸡生长的第一限制性氨基酸,精氨酸是幼年动物生长所必需的,色氨酸在各种蛋白质来源中较少,蛋氨酸是产蛋鸡的第一限制性氨酸酸,这些氨基酸的在大幅度增加,与饲料发酵后粗蛋白含量的增加有关。同时,饲料在发酵过程中,微生物能促进蛋白质降解为氨基酸,这可能是EM原露提高蛋白质和氨基酸的利用率、促进动物生长的可能机理之一。 4.EM原露发酵饲料对肉仔鸡生产性能的影响 组 处理 指标 1周龄 2周龄 3周龄 4周龄 A B C B(对照) B+EM原露10 B+EM原露30 体 重 (克) 119.9±1.27b 122.2±3.95b 126.8±8.85a 300.9±8.72b 310.6±13.4ab 324.0±24.6a 572.6±25.34c 601.3±16.01b 625.4±23.34a 796.5±41.04b 858.9±24.37a 838.4±39.62ab A B C B(对照) B+EM原露10 B+EM原露30 饲料 转化 效率 1.08±0.08a 1.05±0.05a 0.97±0.01b 1.32±0.04a 1.25±0.06ab 1.22±0.03b 1.54±0.04a 1.52±0.05a 1.49±0.04b 1.76±0.04a 1.68±0.06b 1.73±0.03a 组 处理 指标 5周龄 6周龄 比对照 A B C B(对照) B+EM原露10 B+EM原露30 体 重 (克) 1079.3±7.64b 1175.6±16.38a 1133.3±57.74a 1302.2±46.2b 1408.0±24.58a 1394.9±20.90a - ±105.8克 ±92.7克 A B C B(对照) B+EM原露10 B+EM原露30 饲料 转化 效率 1.91±0.06a 1.84±0.07a 1.86±0.05b 2.29±0.03a 2.13±0.03b 2.17±0.10b - -0.16 -0.12 注:同列数字含有不同字母的表示差异显著(P〈0.05〉,反之为差异不显著(P)0.05)。 从表6可以看出,0-3周龄阶段,B组体重和饲料转化率均与对照组差异不显著(P)0.05),C组的体重与对照组差异显著(P〈0.05〉;4-6周龄阶段,C组的饲料转化率和体重与B组相比无显著差异(P)0.05),但B、C两组均明显高于对照组(P〈0.05〉,相比之下,B组的增重更好,饲料转化效率更高。B组肉仔鸡6周龄体重比对照组增加105.8g即8.12%,C组对照组增重7. 12%。B或C组的饲料转化率均显著高于对照组(P〈0.05〉。 Kautz(1990)的研究表明,直接饲用微生物若饲喂过量,则会降低增重,使饲料转化效率下降。这与本研究4-6周龄的试验结果一致。 EM原露促进生长的作用与EM原露发酵饲料后氨基酸含量的增加、EM原露菌分泌的酶及其代谢产物或生物活性物质等有关。 5.EM原露发酵饲料对肉仔鸡免疫器官生长发育的影响 从表7可知,C组的胸腺、脾脏和法氏囊指数均明显高于A组对照(P〈0.05〉,而B组和C组无显著差异(P)0.05),但C组的3 个免疫器官均大于B组。这说明EM原露能明显刺激免疫器官的生长和发育,进而增强免疫功能和抗病能力。 表7 EM原露发酵饲料对免疫器官相对重量的影响(g/kg体重) 组别 处理 器官重/体重 28日龄 42日龄 A B C B(对照) B+EM原露10 B+EM原露30 胸腺指数 2.71±0.12b 2.91±0.36ab 2.97±0.45a 1.66±0.39b 1.78±0.35ab 1.97±0.32 预测 方程 Y=0.763+0.008X R=0.878 Y=1.662+0.104X R=0.998 A B C B(对照) B+EM原露10 B+EM原露30 法氏囊指数 2.18±0.39b 2.56±0.49ab 2.60±0.46a 1.49±0.42b 1.56±0.32ab 1.70±0.37a 预测 方程 Y=2.287+0.012X R=0.814 Y=1.492+0.007X R=0.998 A B C B(对照) B+EM原露10 B+EM原露30 脾脏指数 2.17±0.14b 2.38±0.18ab 2.43±0.31a 1.96±0.37b 2.15±0.25ab 2.27±0.19a 预测 方程 Y=2.222+0.008X R=0.866 Y=1.996+0.099X R=0.944 注:同列数字含有不同字母的表示差异显著(P〈0.05〉,反之为差异不显著(P)0.05)。X为EM原露发酵饲料添加量,Y为各免疫器官相对重量,R为X与Y之间的相关系数。 从EM原露发酵饲料的添加量(x)与免疫器官的相对重量(y)建立的线性回归模型来看,x与y之间存在明显的相关性,其相关系数均大于0.8以上, 说明EM原露对免疫器官生长的刺激强度与EM原露菌的含量有关,EM原露菌越多免疫器官越大,从表7来看,添加10%的EM原露发酵饲料与添加30 %的EM原露发酵饲料并无很大差距,这意味着EM原露添加到一定程度后,其免疫器官重量趋于稳定,并不总是随EM原露的增加而永远增加。从表中还可看出,前期免疫器官相对重量高于后期。 胸腺、法氏囊以及骨髓属于中枢(一级)免疫器官,正常情况下在青春期达到最大,成年后逐渐萎缩。长期生病则提前出现萎缩。比组织结构看,胸腺分皮质和髓质,它对T细胞的成熟和分化起着决定性作用。来自骨髓的淋巴干细胞,有胸腺内经诱导分化,大部分经2-3天便死在这里,只有小部分成熟为T细胞,由髓质经毛细血管后静脉进入血液,输至全身,参与细胞免疫。胸腺上皮细胞表面的免疫相关抗原(Ia抗原)对T细胞的成熟起着一种诱导作用, 使分化过程中产生的许多对自身抗原反应的T细胞得到清除。通过这一过程使成熟T细胞能识别自身抗原和非自身抗原。胸腺能产生胸腺生成和胸腺素等,它们对诱导T细胞成熟有着重要作用。切除胸腺和法氏囊可导致浆细胞数、血清免疫球蛋白、抗体生成减少(杜念兴,1984)。 脾脏、哈德氏腺以及消化道、呼吸道、尿生殖道等部位分散的淋巴组织均属外周(二级)免疫器官,现已证实它们是T、B细胞定居和对抗原刺激进行免疫应答的场所,富含捕获和处理(提呈)抗原的巨噬细胞、树状突细胞(Dendritic c-ells)和朗罕氏细胞(langerhans cell),这些细胞能捕获抗原, 并为处理后的抗原与免疫活性细胞的接触以最大机会。而且,巨噬细胞表面的Ia(免疫相关抗原)分子与抗原形成复合物后产生白介素-1(IL-1)(Chvapil,et al,1-977),IL-1是激活辅助性T细胞(Th)细胞介素,IL-1活化TH细胞产生IL-2和IL-3,IL-2能促进T细胞的增殖,IL-1能促进前B细胞和成熟的B细胞的无性繁殖。因此,脾脏的发育不良会严重影响上述过程,对体液介导的免疫造成巨大伤害。适宜的EM原露水平不仅能促进脾脏的良好生长发育,而且能直接提高机体的细胞免疫和体液免疫功能。 6.EM原露发酵饲料对肉仔鸡细胞免疫功能的影响Con A(Concanavalin A)称刀豆素A,是一种从刀豆中提取的与吡喃葡萄苷、吡喃苷露糖苷和吡喃苷结合的外源凝集素,这些糖苷是细胞膜的蛋白的共同成分,Con A能与这些糖蛋白结合,它是四聚体,对糖有4个结合部位, 作为一个多价的配体在细胞膜上形成蛋白和聚簇,它可以促进T细胞的有丝分裂。而LPS(Lipopolysaccharide, 脂多糖)是脂类和多糖结合的化合物,是细胞膜的共同成分,可以促进B细胞进行有丝分裂。将这些丝裂原与淋巴细胞混合培养,可以促使其进行有丝分裂,分裂的程度可以反映T或B淋巴细胞的活性或功能的强弱。 表8 EM原露对T或B淋巴细胞接受丝裂原刺激反应性的影响 组别 处理 T-细胞 B-细胞 A B C B(对照) B+EM10 B+EM30 0.186±0.01b 0.205±0.03ab 0.215±0.04a 0.190±0.07b 0.210±0.06a 0.216±0.02a 注:同列中含有不同字母的表示差异显著(P〈0.05〉,反之为差异显著。 从表8可以看出,肉仔鸡6周龄时, C组的淋巴细胞转化率明显高于对照组(P〈0.05),说明EM原露对T淋巴细胞接受丝裂原Con A和B淋巴细胞接受丝裂原LPS刺激的反应性有明显的增强作用(P〈0.05)。T细胞是进行细胞免疫应答的主要功能细胞,B细胞是进行体液免疫应答的主要功能细胞,但二者并非独立工作,而是相互作用,又各有分工,与体内的巨噬细胞、K细胞、NK细胞等共同维护机体的正常免疫功能和健康状况。 EM原露增加T或B细胞功能的可能机理是,EM原露是多种微生物的复合物,每一种微生物本身是一种抗原,对T或B细胞具有激活作用,此外还可通过巨噬细胞的抗原提呈作用。对免疫系统发挥重要作用。Fuller(1998)报道, 直接饲用微生物可以提高畜禽抗体水平或提高巨噬细胸的活性,增加免疫功能,它们能刺激肠道免疫组织或机体免疫器官生长,激发机体发生体液免疫和细胞免疫。 7.EM原露发酵饲料对肉仔鸡腹脂沉积的影响 从表9可以发现,B组的腹脂含量比A组降低28.39%,C组比对照组降低36.98%,差异极显著(P〈0.01〉,C组和B组的腹脂含量均明显低于对照组(P〈0.05〉,说明EM原露能显著降低腹脂 沉积,增加瘦肉率。这与李维炯等(1995的报道一致。其可能机理与EM原露发酵饲料中些微生物能分泌淀粉酶和脂肪酶有关,也与通过酸化作用提高体内脂肪酶的活性有关。脂肪酶可以把多余的脂肪分解转化为能量消耗掉,具有自动启动寻找体内多余脂肪进行分解的特性。且可抑制脂肪的吸收与合成。通过上述途径提高了鸡体内脂肪的转化和利用效率,最终降低了脂肪的沉积。 表9 EM原露对肉仔鸡腹脂沉积的影响(42日龄) 组别 处理 腹部脂肪重(g/kg体重) 腹脂变化 A B(对照) 24.19±5.12aA - B B+EM原露10 18.84±4.60bAB -28.39 C B+EM原露30 17.66±5.59bB -36.98 注:数字含有不同字母的表示差异显著(a、b、c为P〈0.05,A、B、C为P〈0.01),反之不显著。 四、结 论 1.经EM原露发酵的饲料PH降低,存在明显的酸化作用,这种作用对动物特别是幼龄畜禽有多种益处(前已述)。 2.用EM原露液对饲料进行发酵后,粗蛋白含量提高,特别是发酵5天后, 能明显提高粗蛋白含量。苏氨酸、精氨酸、酪氨酸、缬氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、色氨酸的增加幅度超过20%,天门冬氨酸、亮氨酸、组氨酸的增加幅度介于15%-20%,其它氨基酸的升高幅度介于10%-15%之间。饲料发酵1、3、5天后,其总氨基酸的增加量分别为8.05%、13.58%和16.3%。 3.用EM原露发酵饲料喂肉仔鸡,能明显提高增重和饲料转化效率。这与许多研究报道一致(李维炯等,1993;孙文柱,1992)。 4.添加10%或30%的EM原露发酵饲料能明显减少腹脂的沉积,增加瘦肉率。 5.EM原露能明显刺激胸腺、脾脏和法氏囊的发育,增强机体的免疫功能。 6.EM原露能明显增强外周血T细胞对丝裂原Con A或B细胞对丝裂原LPS刺激的反应性,说明经EM原露刺激后,T或B淋巴细胞的活性明显增强,亦即能明显增强机体的细胞免疫和体液免疫功能。